植物光合作用為生物提供物質(zhì)、能量和氧氣，光合作用相關(guān)的生物過程必須與生物鐘緊密協(xié)調(diào)，才能最大限度地提高光合效率。鎂是光合作用的重要元素，2020年福建農(nóng)林大學(xué)陳志長課題組報道了一個水稻葉綠體鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白OsMGT3，負(fù)責(zé)向葉綠體節(jié)律性輸入鎂離子，進(jìn)而調(diào)節(jié)光合碳固定（Li et al., Nature Plants, 2020），然而，OsMGT3是如何受到生物鐘調(diào)控來影響光合過程還不清楚。
2022年9月16日，陳志長課題組在國際學(xué)術(shù)期刊Molecular Plant在線發(fā)表了題為“Two central circadian oscillators OsPRR59 and OsPRR95 modulate magnesium homeostasis and carbon fixation by regulating rhythmic expression of OsMGT3 in rice”的研究論文，發(fā)現(xiàn)了兩個核心晝夜節(jié)律振蕩器OsPRR59和OsPRR95負(fù)向調(diào)控水稻OsMGT3的節(jié)律性表達(dá)。該研究認(rèn)為OsMGT3介導(dǎo)的碳固定通過糖信號正向調(diào)節(jié)ROS水平，而ROS又通過誘導(dǎo)OsPRR95和OsPRR59的表達(dá)來抑制OsMGT3。這種反饋回路為增強(qiáng)植物生物鐘和光合作用之間的相互作用提供了一種新的途徑。
該研究首先通過酵母單雜交篩選試驗，發(fā)現(xiàn)PRR家族蛋白能與OsMGT3上游啟動子結(jié)合。考慮到PRR家族在植物生物鐘調(diào)節(jié)中的重要作用，研究者將水稻中所有的PRR進(jìn)行酵母單雜交和EMSA驗證。隨后，研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生各種PRR突變體，發(fā)現(xiàn)只有在osprr95 59雙突變體中才能觀察到OsMGT3表達(dá)水平的顯著變化，暗示OsPRR95和59之間可能存在功能冗余。此外，osprr95 59雙突變體中OsMGT3表達(dá)水平升高，而OsPRR95和OsPRR59過表達(dá)系中OsMGT3表達(dá)水平下降，進(jìn)一步證實了OsPRR95/59對OsMGT3轉(zhuǎn)錄的抑制作用。
OsPRR1, 95和59結(jié)合OsMGT3啟動子抑制其轉(zhuǎn)錄
由于OsMGT3介導(dǎo)了水稻葉綠體中的鎂轉(zhuǎn)運和隨后的碳固定，因此本研究進(jìn)一步對OsPRRs是否也參與葉綠體鎂穩(wěn)態(tài)和光合作用進(jìn)行了分析。與野生型相比，osprr95 59雙突變體的碳同化速率（An）顯著提高，與OsMGT3過表達(dá)株系的An水平相當(dāng)。過表達(dá)OsPRR95或59會降低An在日周期內(nèi)的水平，與osmgt3突變體的水平相似。另外，葉綠體中鎂的含量也是與An呈現(xiàn)出一致的水平。研究者利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的熒光蛋白MARIO來檢測葉綠體中游離鎂離子的含量，發(fā)現(xiàn)OsMGT3和OsPRR95/59的表達(dá)變化在黎明時對基質(zhì)中游離鎂離子的影響很大。這表明OsPRR95和59通過調(diào)控鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因OsMGT3參與葉綠體中游離鎂離子的動態(tài)變化，進(jìn)而調(diào)控光合碳固定。
隨后，研究者通過外源添加不同糖源和各種影響ROS水平的化學(xué)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)OsPRRs-OsMGT3調(diào)控模塊與細(xì)胞體內(nèi)的糖和ROS水平密切相關(guān)。OsPRR95、OsPRR59以及OsMGT3的晝夜節(jié)律性表達(dá)都受到了蔗糖和超氧陰離子的顯著影響。同時，osprr95 59雙突變體和OsMGT3過表達(dá)系在白天內(nèi)源性蔗糖和超氧陰離子水平均升高，而osmgt3突變體和OsPRR95/59過表達(dá)系在白天內(nèi)源性蔗糖和超氧陰離子水平均降低。以上結(jié)果表明糖信號和ROS信號參與了OsPRRs-OsMGT3調(diào)控模塊，并形成負(fù)反饋回路。
鑒于OsPRRs-OsMGT3-sugar-ROS反饋回路需要鎂轉(zhuǎn)運的參與，因此研究者進(jìn)一步調(diào)查了該回路與缺鎂脅迫的關(guān)系。結(jié)果顯示，缺鎂脅迫顯著降低了光合碳固定，但是增強(qiáng)了ROS以及蔗糖在水稻體內(nèi)的大量積累。缺鎂脅迫處理后OsMGT3的表達(dá)被顯著抑制，而OsPRR95和59的表達(dá)則顯著升高。有趣的是，添加DPI來抑制超氧陰離子后，導(dǎo)致缺鎂誘導(dǎo)的光合抑制和基因表達(dá)量的改變被減弱，但對蔗糖積累影響不大。以上結(jié)果表明，水稻通過整合缺鎂信號與這個反饋回路來對缺鎂脅迫做出生理響應(yīng)，也說明OsPRRs-OsMGT3調(diào)控途徑可以提高水稻在不利環(huán)境中的生存適應(yīng)性。
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